TEORIE, PRAXE A ÚDRŽBA: HPLC – Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – základy a principy

Pro separaci se využívá distribuce látek mezi dvě fáze, mobilní/pohyblivou a stacionární/nepohyblivou.

Z hlediska fyzikálně-chemického principu dělení můžeme kapalinovu chromatografii rozdělit na:

• adsorpční chromatografii - k separaci dochází v důsledku specifických interakcí látek se stacionární fází tvořenou pevnými, nemodifikovanými částicemi
• rozdělovací chromatografii - látky jsou zachytávány v kapalné stacionární fázi, která je nanesená na pevném nosiči
• iontově-výměnnou chromatografii - slouží k separaci iontů na stacionární fázi, kterým je nosič s navázanými nabitými funkčními skupinami
• gelovou (permeační) chromatografii - kdy dochází k dělení látek na základě velikosti částic, které se zachytávájí ve stacionární fázi tvořené gelem s jasně definovanou velikostí pórů
• afinitní chromatografii – která umožňuje oddělení příbuzných proteinů z komplexní směsi, na základě interakce s nosičem s imobilizovanými ligandy
• speciální chromatografie – chirální aj.

+ 20 zdarma dostupných webinářů Agilent Technologies na téma akademie a principy HPLC v databázi

School Series of LC Basic Chapter

• Pochopení nuancí HPLC kolon
• Výběr správné chemie kolony
• Pochopení dopadu stacionární fáze kolony na selektivitu
• Jak zvýšit produktivitu vaší laboratoře
• Základní teorie a principy HPLC chromatografů
• Typy hardwaru (čerpadla, autosamplery, termostaty kolon a detektory)
• Tipy a triky pro odstraňování problémů souvisejících s hardwarem

School Series of LC Advanced Chapter

• Současné trendy ve vývoji HPLC metod
• Systematické přístupy
• Jak začít s vývojem HPLC metody
• Služby pro celou laboratoř
• Pokročilé tipy a triky pro odstraňování problémů
• Vliv parametrů pokročilých metod v HPLC
• Klíčové unikátní vlastnosti UHPLC systémů

Obecně se kapalinový chromatograf skládá z:

• vysokotlakého čerpadla (pumpy) – slouží k transportu mobilní fáze
• zařízení pro dávkování vzorku – automatické nebo manuální
• chromatografické kolony (stacionární fáze) – ta může být v termostatovaném prostoru
• detektoru - zaznamenává signál, který je dán rozdílem mezi průchodem čisté mobilní fáze a mobilní fází obsahující eluovanou složku (vzorek)
• také může obsahovat řadu obměn – další detektor i pumpu, frakční kolektor, soustavu ventilů apod.

Smyslem tohoto článku je pak vysvětlit tok mobilní fáze systémem HPLC na jedné z nejčastěji používaných sestav Agilent Technologies.

Na Obrázku 1 můžete vidět schéma, kde mobilní fáze prochází kvartérní pumpou, jejíž součástí je degasser pro její odplynění a která umožňuje míchání až čtyř různých rozpouštědel. K tomuto nízkotlakému míchání dochází ve směšovacím ventilu (MCGV - multi channel gradient valve), následně pak mobilní fáze proudí do vstupního ventilu před prvním pístem pumpy.

Tento ventil může být řízen elektronicky (AIV - active inlet valve) a nebo pohybem pístu (PIV – passive inlet valve). Prvním pístem je pak mobilní fáze tlačena do výstupního ventilu (outlet valve) a na tlumič rázů (damper), jehož součástí je i tlakový senzor. Přes druhý píst proudí mobilní fáze do promývacího ventilu (purge valve), který ji pouští buď do odpadu a promývá se pouze pumpa a nebo dál do zbytku sestavy.

HPST: Obrázek 1 Schéma toku mobilní fáze kapalinovým chromatografem s UV detekcí

Pokud je promývací ventil zavřený, jde mobilní fáze kapilárou do dávkovacího ventilu autosampleru. Nedochází-li v dané chvíli k nástřiku vzorku, proudí tato fáze skrz dávkovací zařízení, smyčku, jehlu a sedýlko zpět do dávkovacího ventilu. To je hlavní výhoda automatických samplerů firmy Agilent Technologies, že vnitřní části, potřebné pro nadávkování vzorku, jsou neustále promývány mobilní fází a tím se snižuje možnost přenosu analytů z jednoho vzorku do druhého.

Z autosampleru proudí mobilní fáze na chromatografickou kolonu, kde po nadávkování vzorku dochází k separaci jednotlivých složek vzorku, které jsou dále unášeny do detektoru diodového pole (DAD).

Detekce těchto složek v DAD je pak dána absorbancí paprsku světla konkrétní vlnové délky při průchodu analytickou celou, kterou také prochází mobilní fáze.

V chromatografickém softwaru pak můžeme rozdíl mezi absorbancí čisté mobilní fáze a absorbancí mobilní fáze s odseparovanou složkou vzorku pozorovat jako chromatogram. Z cely detektoru odchází mobilní fáze do odpadu, případně do frakčního kolektoru či dalšího detektoru.

Správné pochopení toku mobilní fáze pak může uživatelům usnadnit diagnostiku problému, který se může projevit nestandardněm vysokým nebo naopak nízkým zpětným tlakem v HPLC systému. Tento tlak je kontinuálně monitorován tlakovým senzorem a může být sledován v chromatografickém softwaru.

Příští díl servisního okénka HPLC by měl být věnován jednotlivým typům HPLC/UHPLC pump, které na náš trh dodává společnost Agilent Technologies.

Přehled literatury k základům a principům v kapalinové chromatografii od Agilent Technologies (ke stažení v knihovně LabRulezLCMS)

• HPLC Separation Fundamentals - LC Columns and Consumables (Prezentace | 2007)

• HPLC Troubleshooting Fundamentals (Prezentace | 2021)

• Mass Spectrometry Fundamentals –Theory (Prezentace | 2016)

• SAMPLE PREPARATION FUNDAMENTALS FOR CHROMATOGRAPHY (Příručky | 2013)

• Eliminate your Application and Chromatography Challenges - Optimizing your Application/Method Transfer considerations (Prezentace | 2020)

• Eliminate your Application and Chromatography Challenges - Troubleshooting your Method, Application/Chromatography (Prezentace | 2020)

• Is 2D HPLC the Answer for You (Prezentace | 2021)

• Demystifying the Chromatographic Process (Prezentace | 2014)

• HPLC Method Development Systematic Approach vs Random Walk - Improving the Efficiency of Method Development and Optimization (Prezentace | 2014)

• Can I Really Enjoy the Benefits of the Latest LC Column Technology? (Prezentace | 2016)